ЛАУРЕАТ В НОМИНАЦИИ «ПРОРЫВ»

Свет в живой природе

Свечение живых организмов издавна привлекало внимание человечества. Еще Плиний Старший отмечал свет в море, который был вызван особыми микроорганизмами. Летом такой эффект можно увидеть, например, ночью на Черном море. Люминесцирующие насекомые – светляки – вошли в фольклор многих народов.

Биолюминесценция представлена во всех царствах живой природы, кроме растений.

Существуют люминесцентные бактерии, морские животные, насекомые, грибы… Всего биологам известно более 700 видов люминесцентных животных, относящихся к 17 типам.

Уже в XVII веке Роберт Бойль сумел увидеть сходство между биолюминесценцией и горением, показав, что для обоих процессов необходим кислород. Долгое время считалось, что светиться организмы заставляет находящийся в них белый фосфор.

Флуоресценция и люминесценция

Нужно различать флуоресценцию и люминесценцию, потому что с точки зрения физики процесса, это – совершенно разные вещи.

При флуоресценции (того же зеленого или красного флуоресцентного белка, широко использующегося в биологии) молекула сначала поглощает квант света, а затем переизлучает его на какой-то длине волны. Зеленый флуоресцентный белок – в зеленой области спектра, красный – в красной и так далее.

При люминесценции молекула самостоятельно излучает квант света.

Такие разные люциферины

В конце XIX века французский фармаколог Рафаэль Дюбуа сумел показать, что биолюминесценция – это не результат свечения белого фосфора и у нее совсем иная природа.

В случае с биолюминесценцией свет испускает особая молекула люциферина (органическая, небелковая), которая под действием фермента люциферазы (белок) и кислорода окисляется, а затем возвращается в исходное состояние с испусканием кванта света. Нужно сказать, что в словах «люциферин» и «люцифераза» в данном случае нет ничего дьявольского: «люцифер» в переводе с латыни означает «несущий свет».

Оказалось, что в природе существует более 30 типов люминесценции, каждому из которых соответствует свой люциферин. До работ лауреата известно было только 7 молекул различных люциферинов, первый из которых – бактериальный люциферин – был открыт в 1953 году.

За что Илья Ямпольский удостоен премии «ВЫЗОВ»?

Научный комитет Национальной премии в области будущих технологий «ВЫЗОВ» присудил премию «ВЫЗОВ» в номинации «Прорыв» Илье Викторовичу Ямпольскому (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) за расшифровку молекулярных механизмов биолюминесценции и создание светящихся растений доктору химических наук.

Работы в области биолюминесценции Илья Ямпольский начал совместно с лауреатом Нобелевской премии по химии 2008 года Осаму Симомурой, первооткрывателем зеленого флуоресцентного белка в рамках мегагранта в Сибирском федеральном университете и человеком, расшифровавшим структуры двух из семи известных люциферинов. Тогда были изучены механизмы люминесценции двух червей, обитающих в Красноярском крае. И при этом оказалось, что у двух близких видов совершенно разные механизмы люминесценции.

Установить молекулу люциферина, отвечающего за свечение червей, оказалось непросто. Сначала при помощи методов ядерного магнитного резонанса и масс-спектрометрии, а также анализом биохимических путей удалось установить четыре фрагмента этой молекулы и места их соединения. Затем методами органического синтеза Ямпольский с коллегами синтезировал все четыре варианта молекулы люциферина, которые соответствуют ЯМР-спектру и данным масс-спектрометрии, и найти ту, которая светится в присутствии люциферазы.

Следующим этапом стала первая в мире расшифровка структуры люциферина грибов, которую коллектив под руководством Ильи Ямпольского сделал в 2015 году, а затем – люциферина морского многощетинкового червя Odontosyllis, расшифрованного в 2019 году.

От царства к царству

После того, как в 2018 году Илья Ямпольский сделал полную расшифровку всего биохимического пути (оказалось, что ключевая молекула для производства люциферина грибов – кофейная кислота, которая синтезируется и в растениях) и идентификацию всех четырех генов, участвующих в биолюминесценции различных грибов, возникла идея перенести всю эту цепочку в растительное царство.

Первые светящиеся растения были созданы в 1986 году, когда ген люциферазы светляка был генной инженерии встроен в табак, однако растение светилось слабо и только при внешней подпитке люциферином.

Группе Ильи Ямпольского удалось полностью встроить все гены, отвечающие за синтез самой люциферазы и производство люциферина грибов в различные растения, затем добиться усиления свечения в сотни раз. А после наладить коммерческий выпуск комнатных светящихся растений, параллельно продолжая научные исследования – поиск новых люциферинов и улучшение характеристик растений. Создание светящихся растений вошло в список лучших изобретений 2024 года по версии журнала Time и попало на его обложку.

Зачем это нужно?

Создание коммерчески доступных светящихся комнатных растений (к сожалению, пока их продажа в России их не разрешена) – само по себе весьма крупный бизнес. Однако дальнейшее развитие технологии может привести к более интересным применениям. И речь даже не о потенциальном ботаническом саде в стиле фильма «Аватар».

Использование люминесценции вместо флуоресценции в качестве биомаркера позволяет избавиться от фонового света, присущего флуоресцентным системам и не фототоксично. Открытые лауреатом люциферин-люциферазные системы широко применяются в биологии, биомедицинских исследованиях и клинической медицине.

Разработанный Ямпольским метод переноса целых биохимических цепочек из царства в царство может быть в будущем использован для решения такой важнейшей проблемы, как фиксация азота самими растениями.

Биолюминесценция — свечение живых организмов — издавна привлекала внимание человечества. Еще Плиний Старший отмечал свечение моря, а свет светлячков вошел в фольклор многих народов. Уже в XVII веке Роберт Бойль сумел увидеть сходство между биолюминесценцией и горением, показав, что и для первой, и для второго необходим кислород. Долгое время считалось, что светиться организмы заставляет находящийся в них белый фосфор.

В конце XIX века французский фармаколог Рафаэль Дюбуа сумел показать, что биолюминесценция имеет иную природу. В ней задействованы два вещества: небелковая молекула люциферин, которая окисляется под действием кислорода и фермента люциферазы («Люцифер» в переводе с латыни — «несущий свет»).

До работ лауреата было известно всего семь люциферинов, обеспечивающих люминесценцию некоторых бактерий, светлячков, червей, динофлагеллятов, ракообразных и медуз.

Илья Ямпольский с коллегами сумел открыть новые люциферины, в том числе обеспечивающие свечение грибов, расшифровать полный биохимический путь люминесценции, а затем — впервые в мире — методами генной инженерии полностью перенести этот биохимический путь, все необходимые гены, в растения. Так были созданы первые в истории светящиеся растения. Затем команда лауреата сумела увеличить светимость этих растений в тысячу раз и наладить коммерческое производство светящихся комнатных растений.

Однако этим заслуги лауреата не ограничиваются. Метод генноинженерной биолюминесценции с использованием системы люциферин/люцифераза уже широко применяется в биологии и биомедицинских исследованиях, при этом он имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционными маркерами — флуоресцентными белками, поскольку не имеет фонового излучения и не фототоксичен.

Более того, созданный метод переноса целых биохимических цепочек от одного царства к другому открывает дорогу к инженерии новых признаков в эукариотах, включая фиксацию атмосферного азота.

Загадка свечения живых существ и растения из «Аватара»

Биолюминесценция

Первые известия о биолюминесценции относятся еще ко времени античности. Аристотель упоминал свечение гнилых деревьев, Плиний Старший в своей «Естественной истории» отмечал еще и свечение моря. Сейчас мы знаем, что этот эффект, который можно наблюдать, например, на черноморском побережье, вызван ночесветками Noctiluca scintillans – одноклеточными организмами из типа динофлагеллят Dinoflagellata.

Ночесветка Noctiluca scintillans

В настоящее время биологи описали более 700 видов люминесцирующих организмов из 17 типов. Среди них есть бактерии, грибы, морские и наземные животные – но не растения. К слову, среди светящихся животных выделяют животных с аутогенным светом (светящихся самостоятельно) и с бактериогенным светом (в таких организмах светятся бактерии-симбионты).

Природа «живого света» долгое время оставалась непонятной. Лишь в XVII веке выдающийся естествоиспытатель, один из основателей Лондонского королевского общества и исследователь кислорода Роберт Бойль, сумел доказать химическую природу биолюминесценции светляков и гнилушек, установив, что для этого процесса, как и для горения, необходим кислород.

Долгое время в науке существовало мнение, что люминесценция живых организмов вызвана свечением белого фосфора, находящегося где-то в тканях. Только в 1880-х годах французский фармаколог Рафаэль Дюбуа (известный своими трудами по анестезии), изучая сначала свечение жука огненосного щелкуна Pyrophorus noctilucus, а затем – моллюска Pholas dactylus, сумел доказать, что фосфор здесь ни при чем.

Оказалось, что для свечения, помимо кислорода, нужны два компонента: особый белок и органическая молекула-субстрат. В статье, посвященной люминесценции моллюска Pholas dactylus, вышедшей в 1887 году, Дюбуа предложил называть белок-фермент люциферазой, а молекулу-субстрат люциферином (от латинского lux – свет, fer – несущий). Впрочем, слово «фосфор» тоже означает «несущий свет». Только по-гречески.

Работы Дюбуа продолжил британский химик Эдмонд Ньютон Харви, который в начале XX века попытался продемонстрировать взаимозаменяемость у разных видов люциферина и ферментов, которые производят свет, воздействуют на него, и показать, что у всех биолюминесцентных организмов был общий предок. Однако он обнаружил, что эта гипотеза неверна: у разных организмов люциферины и люциферазы различаются. Следующие 30 лет жизни он посвятил неудачным попыткам выделения люциферина.

Современное комплексное изучение биолюминесценции начинается с работ нобелевского лауреата Осаму Симомуры. Именно этот ученый, получивший Нобелевскую премию по химии 2008 года за открытие и применение зеленого флуоресцентного белка, в 1957 году расшифровал структуру люциферина остракод Cypridina hilgendorfii, которые использовались во время Второй Мировой Войны японцами как природный люминофор: высушенные рачки при смачивании снова начинали светиться.

Именно с Симомурой ровно полвека спустя и начиналась работа в области биолюминесценции лауреата премии «ВЫЗОВ» 2025 года.

Вклад лауреата

В рамках мегагранта Осаму Симомуры в Сибирском федеральном университете Илья Ямпольский отвечал за химическую часть работы.

В рамках этой коллаборации удалось изучить и установить механизмы люминесценции двух червей, обитающих в Красноярском крае. При этом оказалось, что у двух близких видов совершенно разные механизмы люминесценции.

Определить структуру молекулы, отвечающей за свечение люциферина червей оказалось непросто. Сначала при помощи методов ядерного магнитного резонанса и масс-спектрометрии, а также анализом биохимических путей удалось установить четыре фрагмента этой молекулы и места соединения этих фрагментов.

Составные фрагменты молекулы люциферина и потенциальные места их соединений

Затем методами органического синтеза Ямпольский с коллегами синтезировал все четыре варианта молекулы люциферина, которые соответствовали ЯМР-спектру и данным масс-спектрометрии, и найти ту, которая светится в присутствии люциферазы.

Четыре варианта структуры люциферина

Новым этапом в изучении «живого света» стала расшифровка структуры люциферина грибов, которую коллектив под руководством Ильи Ямпольского сделал в 2015 году – первым в мире. При этом предшественник люциферина был изначально найден в несветящихся грибах. Им оказался гиспидин, который в свою очередь получается из кофейной кислоты, после чего удалось расшифровать и весь биохимический путь люциферина – от кофейной кислоты до структуры оксилюциферина. Оказалось, что превращение люциферина в оксилюциферин происходит по механизму, похожему на ретро-реакцию Дильса-Альдера.

Механизм свечения люциферина с присоединением молекулы кислорода и последующим отщеплением СO2.

Группе Ямпольского удалось найти структуру еще одного люциферина, морского многощетинкового червя Odontosyllis, расшифрованного в 2019 году. Таким образом, лауреат увеличил количество известных науке люциферинов более чем в полтора раза.

После того, как в 2018 году Илья Ямпольский сделал полную расшифровку всего биохимического пути (оказалось, что ключевая молекула для производства люциферина грибов – кофейная кислота, также синтезируется и в растениях) и идентификацию всех четырех генов, участвующих в биолюминесценции различных грибов, возникла идея перенести всю эту цепочку в растительное царство.

Первые светящиеся растения были созданы в 1986 году, когда ген люциферазы светляка был при помощи генной инженерии встроен в табак, однако растение светилось слабо и только при внешней подпитке люциферином.

Группе Ильи Ямпольского удалось полностью встроить все гены, отвечающие за синтез самой люциферазы и производство люциферина грибов в различные растения, затем добиться усиления свечения в сотни раз путем тонкой «настройки» параметров биохимического каскада, включая частоты употребления кодонов, подбор регуляторных генетических элементов, метаболическую инженерию и направленную эволюцию ферментов. А затем и наладить коммерческий выпуск комнатных светящихся растений, параллельно продолжая научные исследования – поиск новых люциферинов и улучшение характеристик светящихся растений. Создание и коммерческое производство светящихся растений вошло в список лучших изобретений 2024 года по версии журнала Time и попало на обложку журнала.

Среди современных исследований группы Ямпольского – внедрение биохимического пути люминесценции грибов в млекопитающих и дрожжи, а также создание гибридных биохимических путей, сочетающих фрагменты, «позаимствованные» и у грибов, и у растений.

Применение

Создание коммерчески доступных светящихся комнатных растений (к сожалению, пока что продажа в России их не разрешена) – само по себе весьма крупный бизнес. Однако дальнейшее развитие технологии может привести к более интересным применениям. И речь даже не о потенциальном ботаническом саде-аттракционе в стиле фильма «Аватар», хотя это тоже возможный вариант, как и вариант летнего (или круглосуточного в случае южных регионов мира) уличного освещения при помощи люминесцентных деревьев.

Использование люминесценции вместо флуоресценции в качестве биомаркера позволяет избавиться от фонового света, присущего флуоресцентным системам, и не фототоксично. Открытые лауреатом люциферин-люциферазные системы широко применяются в биологии и биомедицинских исследованиях.

Разработанный Ямпольским метод комплексного переноса целых биохимических цепочек из царства в царство может быть в будущем использован для решения такой важнейшей проблемы, как фиксация азота самими растениями.

Литература:

Harvey, E. (1957). A History of Luminescence: From the Earliest Times Until 1900. Philadelphia: American Philosophical Society.

Poisson, Jacques (2010). "Raphaël Dubois, from pharmacy to bioluminescence". Rev Hist Pharm (Paris) (in French). 58 (365). France: 51–6. doi:10.3406/pharm.2010.22136

Harvey, E. Newton (1932). "The evolution of bioluminescence and its relation to cell respiration". Proceedings of the American Philosophical Society. 71: 135–141.

P. J. Herring: Systematic distribution of bioluminescence in living organisms. In: J Biolumin Chemilumin., 1(3), 1987

Основные статьи лауреата:

Living Light from Fungi. Stevani C.V., Zamuner C.K., Bastos E.L., de Nóbrega B.B., Soares D.M.M., Oliveira A.G., Shakhova E.S., Sarkisyan K.S., Yampolsky I.V., Kaskova Z.M. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews, 2024, 58, 100654.DOI: 10.1016/j.jphotochemrev.2024.1006543.

An Improved Pathway for Autonomous Bioluminescence Imaging in Eukaryotes. Shakhova E.S., Karataeva T.A., Markina N.M., Mitouchkina T.Y., Palkina K.A., Wood M.G., Hoang T.T., Hall M.P, Fakhranurova L.I., Perfilov M.M, Blokhina A.E., Malyshevskaia A.K., Gorbachev D.A.,Bugaeva E.N., Pletneva L.K., Babenko V.V., Balakireva A.V., Choob V.V., Encell L.P, Wood K.V., Yampolsky I.V., Sarkisyan K.S., Mishin A.S. Nature Methods, 2024, –, 1-5. DOI: 10.1038/s41592-023-02152-y4.

Structure Elucidation of Keroplatus (Diptera: Keroplatidae) Fungus Gnat Oxyluciferin. Kotlobay A.A., Dubinnyi M.A., Kovalchuk S.I., Makhin A.P., Miturich V.S., Lyakhovich M.S., Fontaine D.M., Southworth T.L., Shmygarev V.I., Yatskin O.N., Branchini B.R., Yampolsky I.V., Kaskova Z.M.Biochemical and Biophysical Research Communications, 2023, 676, 1-5. DOI: 10.1016/j.bbrc.2023.07.0355.

Deazaflavin Cofactor Boosts Earthworms Henlea Bioluminescence. Petushkov V.N., Vavilov M.V., Ivanov I.A., Ziganshin R.H., Rodionova N.S., Yampolsky I.V., Tsarkova A.S., Dubinnyi M.A. Organic & Biomolecular Chemistry, 2023, 21, 415-427. DOI:10.1039/D2OB01946A6.

Plants with Genetically Encoded Autoluminescence. Mitiouchkina T., Mishin A.S., Somermeyer L.G., Markina N.M., Chepurnyh T.V., Guglya E.V.,Karataeva T.A., Palkina K.A., Shakhova E.S., Fakhranurova L.I., Chekova S.V., Tsarkova A.S.,Golubev Y.V., Negrebetsky V.V., Dolgushin S.A., Shalaev P.V., Melnik O.A., Shipunova V.O.,Deyev S.M., Bubyrev A.I., Pushin A.S., Choob V.V., Dolgov S.V., Kondrashov F.A., Yampolsky I.V., Sarkisyan K.S. Nature Biotechnology, 2020, 38, 944-946. DOI: 10.1038/s41587-020-0500-97.

Bioluminescence Chemistry of Fireworm Odontosyllis. A.A. Kotlobay, M.A. Dubinnyi, K.V. Purtov, E.B. Guglya, N.S. Rodionova, V.N. Petushkov, Y.V. Bolt, V.S. Kublitski, Z.M. Kaskova, R.H. Ziganshin, Y.V. Nelyubina, P.V. Dorovatovskii, I.E. Eliseev, B.R.Branchini, G. Bourenkov, I.A. Ivanov, Y. Oba, I.V. Yampolsky, A.S. TsarkovaProceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 2019, 116, 38, 18911-18916.8.

Genetically Encodable Bioluminescent System From Fungi. Kotlobay A.A., Sarkisyan K.S., Mokrushina Y.A., Marcet-Houben M., Serebrovskaya E.O., Markina N.M., Somermeyer L.G., Gorokhovatsky A.Y., Vvedensky A., Purtov K.V., Petushkov V.N., RodionovaN.S., Chepurnyh T.V, Fakhranurova L.I., Guglya E.B., Ziganshin R., Tsarkova A.S., Kaskova Z.M., Shender V., Abakumov M., Abakumova T.O., Povolotskaya I.S., Eroshkin F.M, Zaraisky A.G., MishinA.S., Dolgov S. V., Mitiouchkina T.Y., Kopantzev E.P., Waldenmaier H.E., Oliveira A.G., Oba Y., Barsova E., Bogdanova E.A., Gabaldón T., Stevani C.V., Lukyanov S., Smirnov I.V., Gitelson J.I.,Kondrashov F.A., Yampolsky I.V..Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A, 2018,115, 50, 12728-12732.DOI: 10.1073/pnas.18036151159.

Mechanism and Color Modulation of Fungal Bioluminescence. Kaskova Z. M., Dörr F. A., Petushkov V. N., Purtov K. V., Tsarkova A. S., Rodionova N. S., Mineev K. S., Guglya E. B., Kotlobay A., Baleeva N. S., Baranov M. S., Arseniev A. S., Gitelson J. I., LukyanovS., Suzuki Y., Kanie S., Pinto S., Mascio P. Di, Waldenmaier H. E., Pereira T. A., Carvalho R. P., Oliveira A. G., Oba Y., Bastos E. L., Stevani C. V., Yampolsky I. V.Science Advances, 2017, 3, e1602847. DOI: 10.1126/sciadv.160284710.

The Chemical Basis of Fungal Bioluminescence. Purtov K.V., Petushkov V.N., Baranov M.S., Mineev K.S., Rodionova N.S., Kaskova Z.M., Tsarkova A.S., Petunin A.I., Bondar V.S., Rodicheva E.K., Medvedeva S.E., Oba Yuichi, Oba Yomiko, ArsenievA.S., Lukyanov S., Gitelson J.I., Yampolsky I.V.Angewandte Chemie International Edition, 2015, 54, 8124–8128. DOI: 10.1002/anie.201501779